Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ".
7.1. Питательные среды
Транспортные среды:
- 1-процентная пептонная вода, рН 8,5 +/- 0,1, без ингибиторов
роста сопутствующей флоры и с теллуритом калия (см. среды обогащения);
- 2-процентный раствор поваренной соли: 20 г хлорида натрия и 0,1
г едкого натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды; жидкость
фильтруют через бумажный фильтр, разливают по 10 мл в пробирки и
стерилизуют в автоклаве 20 мин. при 0,7 атм.
Среды обогащения
а) Основной раствор пептона готовят по следующей прописи:
Пептон сухой - 100,0
Натрия хлорид - 50,0
Калия нитрат - 10,0
Натрия карбонат - 25,0
Дистиллированная вода - 1 л
рН 8,4 +/- 0,1.
В холодную дистиллированную воду погружают пептон, хлорид и
карбонат натрия. Смесь кипятят при постоянном помешивании до полного
растворения пептона, не допуская его пригорания, затем добавляют
нитрат калия. Проверяют реакцию среды, если нужно, рН доводят до 8,5
+/- 0,1. Раствор фильтруют через миткалевый или бумажный фильтр,
разливают в посуду и стерилизуют в автоклаве 20 мин. при 1 атм.
Основной раствор пептона сохраняется до 2 лет.
б) 1-процентная пептонная вода
Для получения 1-процентной пептонной воды концентрированный
раствор разводят в 10 раз дистиллированной водой. После установления
рН 8,5 +/- 0,1 разливают в пробирки или во флаконы и стерилизуют 20
мин. при давлении 0,7 атм.
1-процентную пептонную воду можно готовить и непосредственно из
отдельных компонентов, взяв навески в 10 раз меньше указанных в
рецепте основного пептона. Технология приготовления такая же, как и
основного пептона.
в) Пептонная вода с теллуритом калия
В 1-процентную пентонную воду (рН 8,5 +/- 0,1) после
автоклавирования добавляют теллурит калия в конечном разведении
1:100000 или 1:200000. Предварительно готовят рабочий 0,1-процентный
раствор теллурита калия (1:1000). Срок хранения рабочих растворов 7
дней.
Плотные среды для выделения холерных вибрионов.
Щелочной мясопептонный агар:
Мясная вода - 1 л
Пептон - 10,0
Натрия хлорид - 5,0
Агар-агар - 20,0
рН 8,0 +/- 0,2.
В мясную воду вносят пептон и хлорид натрия. Смесь перемешивают и
подщелачивают 20-процентным раствором едкого натра до рН 8,3 +/- 0,1.
Затем добавляют агар-агар и содержимое помещают в автоклав для варки
среды в начале текучим паром в течение 30 - 40 мин., а затем при 1
атм. 20 мин. Если мясопептонный агар варят на плите, среду кипятят до
полного расплавления агар-агара при постоянном помешивании.
Для получения прозрачной агаровой среды ее после варки с целью
отстоя на 2 - 3 ч оставляют в автоклаве или помещают в термостатную
комнату при температуре 43 +/- 2 ёC, время отстоя лучше продлить до 18
- 20 ч. Отстоявшийся агар осторожно, не взбалтывая, сливают с осадка
на плотный ватно-марлевый фильтр. В фильтрате уточняют реакцию среды,
если требуется, подкисляют ее, но подщелачивать агар на данном этапе
не рекомендуется во избежание выпадения осадка при стерилизации
готовой среды. Профильтрованный агар разливают в посуду и стерилизуют
при 1,0 атм. 20 мин.
Элективные среды.
Рекомендуется использовать питательную среду - для выделения
холерных вибрионов элективно-дифференциальную, сухую, СЭДХ.
Среда обладает выраженными элективными свойствами, обеспечивая
ингибицию сопутствующей микрофлоры (энтеробактерий, протея, кокков и
др.) и практически не влияет на рост вибрионов. Холерные вибрионы O1 и
не O1 групп через 12 - 18 ч формируют на этих средах плоские
прозрачные колонии желтого цвета за счет ферментации сахарозы,
диаметром 1,0 - 2,0 мм; V. parahaemolyticus - мелкие, голубоватые
(цвета среды) с уплотненным центром; V. alqinolyticus - крупные,
желтые; колонии Pseudomonas, Aeromonas - голубые; Enterobacteriaceae -
очень мелкие плотные или полупрозрачные, иногда окрашены в желтый
цвет; колонии протея, как правило, не роятся.
Среды для идентификации вибрионов.
Среды с углеводами для отбора колоний:
Среда Ресселя:
Пептон - 5,0
Натрия хлорид - 5,0
Лактоза - 10,0
Глюкоза - 1,0
Агар-агар - 10,0
Индикатор Андреде - 40 мл
Вода дистиллированная - 1 л
рН 7,3 +/- 0,1.
Среду варят, фильтруют, разливают по 5 - 7 мл в стерильные
пробирки и стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин. Готовую среду
после стерилизации скашивают так, чтобы получить столбик и косяк.
Среда светлая.
Среду можно готовить на 1 - 1,3-процентном питательном агаре,
добавляя к нему в соответствующих концентрациях углеводы и индикатор
Андреде.
Лактозосахарозная среда.
Готовится, как и среда Ресселя, но вместо глюкозы берут сахарозу
в том же количестве.
Среда Клиглера:
1,5 - 1,7-процентный мясопептонный агар или другой слабощелочной
питательный агар - 1 л
Лактоза - 10,0
Глюкоза - 1,0
2-процентный раствор серно-кислого закисного железа - 10,0 мл
0,8-процентный раствор тиосульфата натрия - 10,0 мл
0,4-процентный раствор сульфата натрия - 10,0 мл
1-процентный раствор фенолового красного - 24,0 мл
рН 7,3 +/- 0,1.
Вначале в расплавленном питательном агаре (рН 7,7 +/- 0,1)
растворяют углеводы, затем к нему добавляют свежеприготовленные
растворы железа и солей натрия согласно прописи среды (индикатор на
сероводород). Кроме того, для регистрации кислотообразования добавляют
индикатор феноловый красный. Среду варят, фильтруют, разливают по 5 -
7 мл в стерильные пробирки, стерилизуют 20 мин. при давлении 0,5 атм.
и скашивают по типу среды Ресселя. рН готовой среды 7,3 +/- 0,1, цвет
красный.
Маннозосахарозная среда:
1,5% питательный агар - 1 л
Манноза - 1,0
Сахароза - 10,0
Серно-кислое железо (FeSO4) - 0,2
Гипосульфит натрия (Na2SO3 x 5H2O) - 0,08
Сульфит натрия (Na2SO3) - 0,4
0,2% феноловый красный - 10,0.
После расплавления рН среды довести до 8,0, разлить в пробирки по
5 - 7 мл и стерилизовать при 0,7 атм. 15 мин. Готовую среду после
стерилизации скашивают так, чтобы получить столбик и косяк.
Среды для идентификации.
Среды Гисса.
К 100 мл 1% пептонной воды (рН 7,3 +/- 0,1) без селитры добавляют
0,5 - 1% необходимого углевода или спирта (L-арабиноза, D-манноза,
D-сахароза, D-маннит, L-инозит, D-глюкоза, растворимый крахмал и др.)
и 1% индикатора Андреде или 0,1 мл 1,6% раствора бромтимолового
синего. Среды разливают в стерильные пробирки с поплавками и
стерилизуют при 0,5 атм. 20 мин.; среду с L-арабинозой следует
стерилизовать в течение 20 мин. при 0,1 - 0,2 атм. Для приготовления
сред Гисса можно применять только перечисленные изомеры углеводов.
Готовые среды Гисса с индикатором Андреде светлые, при
кислотообразовании краснеют. Среды с бромтимоловым синим зеленого
цвета с травянистым оттенком, при кислой реакции - желтого цвета, при
щелочной - синего.
Среда Хью - Лейфсона:
Пептон - 2,0
Натрия хлорид - 5,0
Двузамещенный фосфат калия - 0,3
Глюкоза - 10,0
Бромтимоловый синий - 0,03
Агар-агар - 3,0
Дистиллированная вода - 1 л
рН 7,1 +/- 0,1.
К воде добавляют пептон, натрия хлорид и агар-агар. Смесь
подогревают до расплавления агара, затем вносят фосфат калия и
глюкозу, продолжают кипятить 2 - 3 мин. Смесь подщелачивают
20-процентным раствором едкого натрия до рН 7,4 +/- 0,1, доводят объем
среды до первоначального и добавляют 3 мл 1-процентного водного
раствора бромтимолового синего. Затем среду фильтруют через
ватно-марлевый фильтр, разливают по 4 - 5 мл в стерильные пробирки и
стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин. Цвет среды до стерилизации
синий, а после автоклавирования травянисто-зеленый, рН 7,1 +/- 0,1.
При кислой реакции среда желтеет.
Бульон Кларка:
Пептон - 5,0
Глюкоза - 5,0
Двузамещенный фосфат калия - 5,0
Дистиллированная вода - 1 л.
Смесь ингредиентов нагревают до полного их растворения, затем
фильтруют через бумажный фильтр и разливают по 5 мл в стерильные
пробирки. Бульон стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин.
Среда Кодама.
В 1-процентную пептонную воду добавляют 0,5% растворимого
крахмала. Среду разливают в стерильные пробирки и стерилизуют 20 мин.
под давлением 0,5 атм. Для оценки результатов расщепления крахмала
используют реактив Люголя.
Среда с желатиной.
К мясопептонному бульону или бульону Хоттингера прибавляют мелко
нарезанную желатину из расчета 10,0 - 15,0 г на 100 мл (летом
концентрацию желатины увеличивают до 20%). Желатине дают набухать в
течение 30 мин. и затем растворяют при медленном нагревании в водяной
бане при температуре (45,0 +/- 5,0) ёC. Устанавливают рН 7,1 +/- 0,1,
прибавляя к расплавленной желатине 10-процентный раствор
двууглекислого натрия. При более щелочной реакции желатина застывает
плохо, а иногда и совсем не застывает. В 1 л растворенной желатины
вносят для просветления два взбитых с небольшим количеством
дистиллированной воды яичных белка. Смесь перемешивают и прогревают
текучим паром в течение 20 мин. до полного свертывания белка и
просветления среды. Затем среду фильтруют в горячем состоянии через
бумажный или ватно-марлевый фильтр с большой поверхностью. Среду,
разлитую по 5 - 8 мл в пробирки, стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20
мин. После стерилизации среду охлаждают путем погружения пробирок в
холодную воду в строго вертикальном положении, чтобы верхняя часть
столбика при застывании оставалась совершенно ровной.
Среда для определения декарбоксилаз и дигидролаз аминокислот:
Пептон - 5,0
Дрожжевой экстракт - 25,0 (сухой 3,0)
Глюкоза - 1,0
Натрия хлорид - 5,0
Натрия карбонат - 0,1
Бромтимоловый синий (0,1-процентный р-р в 20-процентном спирте) -
45,0 (0,045 г сухого)
Аминокислота - 10 - 20,0
Дистиллированная вода - 1 л
рН 6,4 +/- 0,1.
Все ингредиенты по прописи вышеуказанной среды растворяют при
нагревании, устанавливают рН 6,4 +/- 0,1, затем добавляют
соответствующий индикатор и делят среду на 4 равные части. В одну
часть аминокислоты не добавляют, эта порция служит контролем. В
остальные порции вносят соответственно: в первую - 1% лизина, во
вторую - 1% орнитина, в третью - 1% аргинина. Аминокислоты должны быть
в L-форме, если имеются D-аминокислоты, то добавляют 2%, т.к.
микроорганизмы активны только в отношении L-форм. После добавления
аминокислот перед стерилизацией, в случае необходимости, реакцию среды
исправляют 0,1-процентным раствором соляной кислоты. Среду разливают
по 1 - 2 мл в химически чистые стерильные пробирки и стерилизуют при
давлении 0,1 - 0,2 атм. 20 мин. Небольшое количество флокулята в
средах не имеет значения. Пептонно-дрожжевая среда имеет
травянисто-зеленый цвет, при кислой реакции среда желтеет, при
щелочной - синеет.
Среды для определения гемолитической активности.
Сердечно-мозговой настой:
Сердечный настой - 500,0 мл
Мозговой настой - 500,0 мл
Пептон - 10,0 г
Натрия хлорид - 5,0 г
рН 7,3 +/- 0,1.
Смесь кипятят до полного растворения пептона и соли,
устанавливают необходимую реакцию, разливают в пробирки по 4,0 - 5,0
мл, стерилизуют при 0,7 атм. 20 мин.
Мясопептонный бульон:
Мясная вода с 1-процентным сухим пептоном и 0,85-процентной
поваренной соли. Способ приготовления, стерилизации тот же, что для
сердечно-мозгового настоя.
|
Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ".