Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ".
8.2. Определение вибриоцидных антител в сыворотке
крови (РВА)
Вибриоцидные антитела в крови больных обнаруживаются с 1 - 3
-1 -3
дня болезни в титрах 10 - 10 и достигают максимальных значений
-4 -8
10 - 10 к 10 - 12 дню. Принцип метода во всех его вариантах
заключается в том, что в присутствии вибриоцидных антител не
происходит размножения холерных вибрионов.
При проведении серологических исследований в очаге, обусловленном
возбудителем холеры определенного серовара, в реакции используют один
штамм соответствующего серовара, при отсутствии этих данных - два
штамма обоих сероваров.
Материалы и оборудование:
- исследуемые сыворотки, инактивированные прогреванием 30 мин.
при температуре (56,0 +/- 0,5) ёC;
- сухой комплемент или свежеполученная сыворотка морской свинки в
разведении 1:20;
- 0,9-процентный раствор хлорида натрия рН 7,2 +/- 0,1;
- штаммы холерных вибрионов сероваров Огава и Инаба, типичные в
S-форме, не чувствительные к комплементу;
- чашки Петри со щелочным агаром;
- лоток со льдом;
- термостат на (37,0 +/- 1,0) ёC.
Методика постановки реакции.
Комплемент, разведенный 0,9-процентным раствором хлорида натрия
1:20, разливают в два ряда пробирок по 0,9 мл. В первую пробирку
вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки и после тщательного перемешивания
-10
последовательно переносят по 0,1 мл до разведения 10 , получая
десятикратные разведения сыворотки в объеме 0,9 мл. Титрацию сыворотки
проводят на льду, который помещают в любую емкость.
Из односуточной агаровой культуры холерного вибриона готовят
взвесь в 0,9-процентном растворе хлорида натрия, содержащего в 1 мл
10000 - 20000 м.к. Стерильной градуированной пипеткой полученную
взвесь по 0,1 мл вносят в опытные пробирки с раститрованной
сывороткой.
Необходимы следующие контроли: а) контроль комплемента (0,9 мл
комплемента и 0,1 мл культуры); б) контроль сыворотки (0,8 мл
0,9-процентного раствора хлорида натрия, 0,1 мл сыворотки и 0,1 мл
культуры); в) контроль культуры (0,9 мл 0,9-процентного раствора
хлорида натрия и 0,1 мл культуры).
Штатив с пробирками на 1 ч помещают в водяную баню или термостат
при температуре (37,0 +/- 0,5) ёC, сделав предварительно высев из
пробирки контроля культуры на 2 пластинки щелочного агара для
определения фактической концентрации живых вибрионов в опытной
суспензии (контроль разведения).
Через 1 ч штатив вновь ставят на лед и из каждой пробирки
отдельной стерильной пипеткой 0,1 мл культуры высевают на чашку со
щелочным агаром рН 7,0 +/- 0,1. Посев равномерно распределяют по
поверхности чашки покачиванием или шпателем. Чашки помещают на 18 - 24
ч в термостат при температуре (37,0 +/- 0,5) ёC, после чего
подсчитывают количество выросших колоний.
В посевах из контрольных пробирок с культурой должно вырастать
количество колоний, близкое к контролю разведения.
Вибриоцидным титром считают максимальное разведение сыворотки,
которое вызывает гибель не менее чем 50% клеток холерного вибриона,
что выявляется при посеве на агаровые пластинки в чашки Петри, по
сравнению с количеством выросших колоний из пробирки контроля
комплемента.
Пример вычисления: при посеве из опытных пробирок с
-1 -2 -3 -4 -5 -6 -7
разведением сыворотки 10 ; 10 ; 10 ; 10 ; 10 ; 10 ; 10 и т.д. на
чашках соответственно выросло 0; 0; 5; 10; 15; 30; 38 и т.д. колоний.
При высеве из пробирки контроля комплемента также после часовой
инкубации при температуре (37,0 +/- 0,5) град. С выросло 36 колоний,
50% от этого числа будет составлять 18. Из 5-й пробирки выросло 15
колоний, т.е. меньше 50% от количества колоний в контроле (18), в
следующей - 30, т.е. более 50% этого же показателя. Разведение
-5
сыворотки в 5-й пробирке составляет 10 , следовательно, вибриоцидный
-5
титр в данном примере будет составлять 10 .
Определение вибриоцидных антител (ВА) в сыворотке крови на основе
ферментации углеводов.
Об отсутствии или наличии ВА судят по ферментации сахарозы,
регистрируемой с помощью индикатора.
Материалы и оборудование:
- инактивированная сыворотка крови;
- штаммы холерного вибриона серовара Огава и Инаба;
- комплемент, разведенный 1:20 1-процентной пептонной водой,
содержащей 1% сахарозы и 1% индикатора Андреде;
- термостат на (37,0 +/- 1) ёC.
Методика постановки реакции.
Комплемент, разведенный 1:20 1-процентной пептонной водой с
сахарозой и индикатором Андреде, разливают в пробирки по 0,45 мл. В
первую пробирку добавляют 0,05 мл исследуемой сыворотки и после
тщательного перемешивания переносят 0,05 мл смеси во вторую пробирку,
-5 -9
из второй в третью и т.д. (до разведения 10 - 10 ). Готовят
суспензию 18 - 20-часовой агаровой культуры холерного вибриона и
3
разводят 1-процентной пептонной водой до концентрации 10 м.к./мл в 1
мл. Во все пробирки вносят по 0,45 мл суспензии и помещают в
термостат.
Постановку реакции сопровождают следующими контролями:
- 0,45 мл 1-процентной пептонной воды, содержащей 1% сахарозы и
1% индикатора Андреде + 0,05 мл исследуемой сыворотки + 0,45 мл взвеси
культуры, - контроль сыворотки;
- 0,45 мл комплемента с сахарозой и индикатором + 0,45 мл
культуры - контроль комплемента;
- 0,45 мл 1-процентной пептонной воды с сахарозой и индикатором +
0,45 мл культуры - контроль культуры;
- 0,45 мл 1-процентной пептонной воды с сахарозой и индикатором +
0,05 мл исследуемой сыворотки - контроль стерильности сыворотки.
Через 5 - 6 ч проводят учет реакции. При этом в контроле (кроме
контроля стерильности сыворотки) цвет содержимого пробирок должен
перейти в красный или розовый. Изменение цвета индикатора в пробирках
рабочего ряда, связанное с ферментацией сахарозы размножившимися
вибрионами, свидетельствует об отсутствии вибриоцидных антител в
исследуемой сыворотке. За вибриоцидный титр принимают то наибольшее
разведение сыворотки, при котором цвет содержимого пробирок остается
неизмененным или интенсивность его значительно отличается от окраски
контрольных проб. Результат выражают в виде десятичного логарифма
разведения сыворотки, взятого с обратным знаком.
Примечание. Для постановки РВА при холере, обусловленной холерным
вибрионом O139 серогруппы, не может быть использован выделенный в
очаге штамм в связи с возможной чувствительностью его к комплементу. В
этих случаях рекомендуется предложенный специалистами Ростовского
НИПЧИ ctx- клон холерного вибриона O139, направленный на депонирование
в Государственную коллекцию патогенных бактерий "Микроб" (РосНИПЧИ
"Микроб").
|
Фрагмент документа "МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ".